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        新聞詳情

        詳解高速冷凍離心機提取植物蛋白質方法

        日期:2022-07-02 00:18
        瀏覽次數:1012
        摘要:一、植物安排蛋白質提取辦法 1、依據樣品分量(1g樣品參加3.5ml提取液,可依據材料不同恰當參加),準備提取液放在冰上。 2、把樣品放在研缽頂用液氮研磨,研磨后參加提取液中在冰上靜置(3-4小時)。 3、用冷凍離心機離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清液,樣品制備完畢。 蛋白質提取液:300ml 1、1Mtris-HCl(PH8)45ml 2、甘油(Glycerol)75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g 這種辦法針對SDS-PAGE,垂直板電泳! 二、植物安排蛋白質提取辦法 氯醋酸—丙酮堆積法 1、在液...
        一、植物安排蛋白質提取辦法

        1、依據樣品分量(1g樣品參加3.5ml提取液,可依據材料不同恰當參加),準備提取液放在冰上。

        2、把樣品放在研缽頂用液氮研磨,研磨后參加提取液中在冰上靜置(3-4小時)。

        3、用冷凍離心機離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

        4、提取上清液,樣品制備完畢。

        蛋白質提取液:300ml

        1、1Mtris-HCl(PH8)45ml

        2、甘油(Glycerol)75ml

        3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g

        這種辦法針對SDS-PAGE,垂直板電泳!

        二、植物安排蛋白質提取辦法

        氯醋酸—丙酮堆積法

        1、在液氮中研磨葉片

        2、參加樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜,然后離心(4℃8000rpm以上1小時)棄上清。

        3、參加等體積的冰浴丙酮(含0.07%的β-巰基乙醇),搖勻后離心(4℃8000rpm以上1小時),然后真空枯燥堆積,備用。

        4、上樣前參加裂解液,室溫放置30分鐘,使蛋白充分溶于裂解液中,然后離心(15℃8000rpm以上1小時或更長時間以沒有堆積為標準),可暫時保存在4℃待用。

        5、用Brandford法定量蛋白,然后可分裝放入-80℃備用。

        藥品:提取液:含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮。裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3mlmie菌的去離子水中(終體積為5ml),使用前再參加1M的DTT65ul/ml。

        這種辦法針對雙向電泳,雜質少,離子濃度小的特色!當然單向電泳也相同適用,只是電泳的條帶會削減!

        三、安排:腸黏膜

        目的:WESTERNBLOT檢測凋亡相關蛋白的表達

        使用TRIPURE提取蛋白質進程:

        含蛋白質上清液中參加異丙醇:(1.5ml每1mlTRIPURE用量)

        倒轉混勻,置室溫10min

        離心:12000g,10min,4度,棄上清

        參加0.3M鹽酸胍/95%乙醇:(2ml每1mlTRIPURE用量)

        振蕩,置室溫20min

        離心:7500g,5min,4度,棄上清

        重復0.3M鹽酸胍/95%乙醇步2次

        堆積中參加100%乙醇2ml

        充分振蕩混勻,置室溫20min

        離心:7500g,5min,4度,棄上清吹干堆積

        1%SDS溶解堆積

        離心:10000g,10min,4度

        取上清-20度保存(或可直接用于WESTERNBLOT)

        存在的問題:參加1%SDS后堆積不溶解,仍是很大的一塊,4度離心后又多了白色沉定,SDS結晶?測濃度,含量才1mg/ml左右。

        處理:提蛋白試劑盒,別的安排大小適中,要碎,當即加2XBUFFER,然后煮5-10分鐘,作用很好的。

        四、植物材料:水稻苗,葉鞘,根

        1、200毫克樣品置于冰上磨碎

        2、加lysisbuffer,離心,10000rpm,4度,5min取上清

        3、重復離心5min

        lysisbuffer:ureanp-40ampholine2-mepvp-40

        五、蛋白質樣品制備

        秧苗蛋白質樣品的提取按Davermal等(1986)的辦法進行。

        100mg材料剪碎后參加10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,參加1.5ml10%三***(丙酮制造,含10mM即0.07%β-巰基乙醇),混勻,-20℃堆積1小時,4℃,15000r/min離心15min,棄上清,堆積復溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巰基乙醇),再于-20℃堆積1小時,同上離心棄上清,(有必要再用80%丙酮(含10mMβ-巰基乙醇所得堆積低溫冷凍真空抽干。

        按每mg干粉參加20μl(可調)UKS液[9.5M尿素,5mM碳酸鉀,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫蘇糖醇),2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc,pH3.5-10),6%TritonX-100],37℃溫育30min,期間攪動幾回,28度(溫度低,高濃度的尿素會讓溶液結冰)16000r/min離心15min,離心力越大時間長一點越好!上清即可上樣電泳?;蛟S-70度保存

        六、植物根中蛋白質的抽取

        (1)sample,液氮研磨

        (2)裝1.5mlcentrifuge用tube

        (3)加1MKH2PO4K2HPO4700ul

        (4)12000rpm,4度,10-15minite

        (5)取上層液,蛋白質就在里邊

        滬公網安備 31011802002412號

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